Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA)

       

    Beberapa mikroba tertentu tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan sederhana ataupun Gram, misalnya golongan Mycobacterium, Retinomycites, dll. Hal ini disebabkan sel-sel mikroba diliputi oleh semacam lilin (lipid) dan asam mycolat, sehingga tubuhnya sukar ditembus oleh zat-zat warna. Tetapi dia dapat diwarnai dengan karbolfuchsin panas (sambil dipanasi), ternyata zat warna ini dapat meresap dan diikat oleh tubuh bakteri tersebut. Keistimewaan dari kuman tahan asam ini, zat warna yang telah diikat itu sukar dilepaskan walaupun dilakukan dengan pencucian dengan alkohol-asam, misalnya asam sulfat dan asam chlorida. Oleh karena kuman-kuman seperti itu tahan terhadap pencucian asam-asam mineral, maka disebut kuman tahan asam. Kuman-kuman yang tahan asam ialah:

1. Mycobacterium tuberculose ( bakteri tbc).
2. Mycrobacterium leprae (basil Hansen).
3. Golongan saprophyt (apathogen).
4. Bakteri S*#@?!. S*#@?! Walaupun tahan asam tetapi zat warna yang diikat luntur oleh pencucian decolorisasi (alkohol-asam).

I.    Cara ZIEHL NEELSEN.

Larutan-larutan yang diperlukan :

A.  Carbol-fuchsin : Basic fuchsin          : 1 gram.

                          Alkohol 95%           : 10 ml.

                          Phenol 5% dlm air   :100 ml.

Mula-mula fuchsin dilarutkan dalam alkohol (gerus dalam mortir), kemudian tambah phenol, biarkan 24 jam, saring.    

B.   Alkohol-asam, yaitu 3-5 ml asam chlorida pekat dalam alkohol 95% sampai 100 ml.

C.   Methylen biru biasa, sebagai counter stain.

Methylen biru : 1 gram.

Aquadest       : 100 ml.

Dapat juga digunakan methylen biru menurut Loffler.

Caranya :

1.    Buat sediaan, keringkan di atas api, kemudian disiram dengan carbol-fuchsin.

2.   Panasilah sediaan itu dengan hati-hati sampai kelihatan uap tetapi jangan sampai mendidih, biarkan menguap kira-kira 3-5 menit.

3.   Cuci dengan aquadest kemudian warna carbol-fuchsin dibuang dengan decolorisasi HCl-alkohol.

4.   Pencucian selesai bila air cucian tidak berwarna merah lagi, cuci lagi dengan aquadest.

5.   Warnai dengan counter stain methylen biru, biarkan kira-kira 2-3 menit. (Loffler m. blue 20-30 det).

6.   Cuci dengan air, keringkan di udara dan dilihat dengan mikroskop.

Hasil pewarnaan:

Bakteri tahan asam  : merah.

Tidak tahan asam    : biru.

II.    Cara KINYOUN. (Am. J. Pub. Health th 5: 867, 1915).

A.    Larutan Carbol-fuchsin menurut Kinyoun : Basic fuchsin 4 gram, alkohol 95% 20 ml, phenol 8 gram, dan aquadest 100 ml. Fuchsin digerus dalam mortir dengan alkohol sampai larut. Cucilah berkali-kali mortir itu dengan air dan pindahkan ke dalam botol. Panasilah phenol di atas penangas air 56°C sampai mencair dan tambahkanlah phenol itu ke larutan tadi. Biarkan 24 jam, kemudian disaring dan siap untuk dipakai.

B.    Decolorisasi : HCl 3-5% atau Asam-sulfat 5%.

C.    Counter stain : Methylen biru 1% dalam air.

Caranya :

1.    Buat sediaan, keringkan di atas api, kemudian fiksasi di atas api.

2.    Tuangi dengan larutan Kinyoun, biarkan 3-5 menit.

3.    Cuci dengan air kran mengalir pelan-pelan : ½ menit.

4.    Tetesi dengan asam-sulfat 5%, biarkan : ½ menit.

5.    Bubuhi dengan alkohol 70%, biarkan : ½ menit.

6.    Cuci dengan air kran mengalir pelan-pelan : ½ menit.

7.    Warnai dengan methylen biru, biarkan : 1 menit.

8.   Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop.

Cara Kinyoun tidak perlu dipanasi.

9.   Hasil pewarnaan:

Bakteri tahan asam  : merah.

Tidak tahan asam    : biru.

III.   Cara GOBBET.

1.    Buat preparat, keringkan dan fiksasi di atas api, kemudian tuangi dengan basic-fuchsin yang terdiri dari : basic fuchsin 0,9 gram, alkohol 95% 10 ml, phenol 5% 90ml, panasi sampai keluar uap dan biarkan selama 3-5 menit.

2.     Bersihkan dengan air kran mengalir pelan-pelan ½ menit.

3.     Celupkan ke dalam larutan Gobbet selama 1 menit. Larutan Gobbet terdiri dari : Methylen biru 1 gram, asam-sulfat 96% 20 ml, alkohol absolut 30 ml dan aquadest 50 ml.

4.     Bilasi dengan air kran, keringkan di udara dan dilihat dengan mikroskop.

5.     Hasil pewarnaan:

Bakteri tahan asam  : merah.

Tidak tahan asam    : biru.

IV.    Cara TAN THIAM HOK.

Cara ini merupakan kombinasi dari Kinyoun dan Gabbet.

1.    Sediaan sesudah difiksasi di atas api, celupkan ke dalam larutan Kinyoun selama 3 menit.

2.    Cuci dengan air kran selama ½ menit.

3.    Celupkan lagi dalam larutan Gabbet selama 1 menit.

4.    Bilasi dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar dan dilihat dengan mikroskop.

5.     Hasil pewarnaan:

Basil tahan asam : merah.

Tidak tahan asam : biru muda.