Identifikasi Secara Umum Bakteri Gram Negatif

keymazk.wordpress.com

1.     Karbohidrat (gula-gula).

Untuk mengetahui apakah kuman dapat meragikan gula-gula atau tidak. Jika diragikan apakah terbentuk gas, yang dapat dilihat dalam tabung Durham. Dari peragian ini dapat diambil beberapa penafsiran :

~         Golongan coli dapat meragikan gula-gula di atas dan membentuk gas.

~         Paracolobactrum tidak dapat meragikan laktosa dan saccharosa, gula yang diragikan terbentuk gas.

~         Salmonella dan Shigella tidak dapat meragikan laktosa dan saccharosa.

~         Salmonella paratyphus membentuk gas pada gula-gula lain yang diragikan, sedangkan Salmonella typhi tidak membentuk gas.

~         Shigella juga tidak membentuk gas pada gula yang diragikan, kecuali Shigella New Castle dapat membentuk gas.

~         Vibrio baik biotype klasik maupun biotype ElTor hanya tidak dapat meragikan gula laktosa pada jajaran warna, tetapi tidak membentuk gas pada gula-gula yang diragikan.

2.     Seitz.

Seitz itu hanya untuk mengetahui apakah bakteri itu dapat membentuk asam atau basa.

3.     Semi-solid.

Semi solid, gunanya untuk mengetahui apakah bakteri dapat bergerak (motile) atau tidak bergerak (nonmotile). Bakteri-bakteri yang bergerak akan naik kepermukaan semi-solid, sedangkan bakteri-bakteri yang tidak bergerak hanya tumbuh pada tempat tusukan saja. Pada semi-solid tumbuhnya bakteri kelihatan seperti awan (embun) putih.

Contoh : Gerak +

1)     Serum vibrio.

2)     Serum salmonella (kecuali S.gallinarum dan B.pullorum pada burung).

3)     Golongan coli (kecuali A.Aerogenes).

4)     Malleomyces Pseudomallei.

dll.

Contoh : Gerak –

1)     Semua gol. shigella.

2)     Semua gol. coccus.

3)     Pasteurella pestis.

4)     Semua klebsiella.

5)     Malleomyces mallei.

6)     Aerobacter aerogenes.

dll.

4.     Indol test

Untuk test ini dipakai perbenihan air pepton yang mengandung trypthopan. Pepton yang banyak mengandung trypthopan ialah : Pepton-witte dan Bactopepton. Syarat perbenihan air pepton ialah harus bebas dari glukosa, karena jika ada glukosa, kuman meragikan glukosa menjadi asam. Suasana asam ini mencegah bekerjanya enzyme proteolytic untuk mencernakan tryptophan.

Prinsip reaksi :

            Bakteri yang ditanam pada air pepton, akan memecahkan tryptophan menjadi indol, skatol dan alanin. Indol dengan reagensia indol berwarna merah (rose). Warna merah ini dapat disebabkan oleh : methyl-indol dan alanine (hasil ikutan). Ada beberapa cara untuk mengetahui terbentuknya indol ini.

A.    Menurut Ehrlich.

R/   Paradimethylaminobenzaldehyde : 1 gram.

      Asam chlorida (HCl) pekat pa.       : 20 ml.

      Alkohol absolut (96%)                  : 95 ml.

Pemakaian :

            Kepada perbenihan air pepton yang telah ditanam dengan bakteri 37°C selama 1-2 hari, ditetesi dengan beberapa tetes reagensia. Terbentuk lapisan berwarna merah antara biakan dengan reagensia, reaksi indol positif. Jika tidak terbentuk warna merah, reaksi indol negatif. Jika tabung digoncang, warna merah larut, tambah lagi reagensia.

            Untuk mengetahui warna merah yang terjadi benar-benar karena indol atau karena reaksi ikutan, dapat dilakukan sebagai berikut :

a)     Kepada tabung yang positif tadi dibubuhi dengan chloroform, kocok. Tabung dibiarkan berdiri pada rak. Jika warna merah tetap ada di dalam larutan chloroform, reaksi Indol positif (warna merah bukan karena methylindol atau alanine).

b)    Kepada perbenihan air pepton yang telah ditanam seperti di atas, dibubuhi dengan campuran reagensia + kaliumpersulfat jenuh sama banyak (aa). Warna merah yang terjadi di sini, hanya disebabkan oleh Indol saja.

B.    Menurut Kovacs (modifikasi).

R/   Paradikethylaminobenzaldehyde   : 5 gram.

      Amylalkohol pa.                           : 75 ml.

      Asam chlorida pekat pa.               : 25 ml.

Pemakaian :

            Beberapa tetes kepada perbenihan telah ditanam dengan bakteri, terjadi warna merah maka reaksi Indol positif. Jika sesudah ditetesi dengan reagensia Indol berwarna kuning, berarti Indol negatif.

Reagensia Indol ini senantiasa disimpan dalam lemari es dan warnanya kuning.

5.     Methyl-red test (Clark dan Lubs).

Perbenihan yang dipakai ialah air-pepton yang mengandung glukosa 5% (glucose-phosphat-medium), sudah ditanam dengan bakteri, inkubator pada 37°C selama 1-2 hari ditetesi dengan indikator Methyl-red.

Prinsip : M.R. test gunanya untuk mengetahui apakah bakteri dapat membentuk H-ion yang banyak, sehingga pH di bawah 5 (asam). Keadaan asam ini bila ditetesi dengan reagensia M.R. terjadi warna merah pada lapisan permukaan. Terbentuknya warna kuning : negatif.

Reagensia M.R:

0,1 gram methyl-merah dilarutkan dalam 300 ml alkohol 95-96%, sesudah larut ditambah air sampai volume menjadi 500 ml. Reagensia ini senantiasa disimpan dalam lemari es.

6.     Voges Proskauer test.

Medium yang digunakan ialah sama dengan untuk M.R. test, yaitu glucose-phosphat-medium.

Prinsip : V.P. test gunanya untuk mengetahui apakah bakteri sanggup membentuk acetyl metyl carbinol dari glukosa yang ada dalam medium. Acetyl metyl carbinol ini adalah hasil dari pertengahan dari pencernaan glukosa. Dalam suasana alkalis, acetyl metyl carbinol membentuk warna merah pada lapisan sebelah atas dengan reagensia-reagensia Voges Proskauer.

            Untuk mengetahui terbentuknya acetyl metyl carbinol dapat diperiksa dengan bermacam-macam reagensia, yang terbaik menurut Barrit.

A.    Dengan reagensia Barrit.

1)     Kepada 1 ml kultur yang telah di-eram 1-2 hari pada 37°C ditambah dengan 0,6 ml alpha-naftol 5% dalam alkohol + 0,2 ml KOH 40%. Campur dan dalam 5-20 menit terbentuk warna merah-jambu, acetyl metyl carbinol positif (V.P. positif).

2)     Ada juga dilakukan sebagai berikut: kepada perbenihan 5 ml yang telah ditanam dengan bakteri, sesudah dieram 37°C selama 1-2 hari ditetesi dengan beberapa tetes KOH 16% + beberapa tetes 5% alpha-naftol. Terbentuk warna merah jambu pada lapisan permukaan : V.P. positif. Terbentuk warna hitam : V.P. negatif. Yang paling umum dipergunakan adalah dengan reagensia menurut Barrit.

B.    Dengan reagensia O’Meara.

Kepada 2 ml kultur + beberapa tetes NaOH (KOH) 40% yang mengandung reatin 0,3%. Campur dan bila terbentuk warna merah-eosin dalam waktu kira-kira 15 menit, V.P. positif. Pembentukan warna merah tidak boleh lewat dari 4 jam.

C.    Dengan reagensia Werkman.

Kepada 5 ml kultur + 2-3 tetes FeCl₃ kemudian ditambah dengan 10% NaOH (KOH) sama banyak, kocok sampai bercampur. Terbentuk warna merah pada permukaan medium, V.P. positif.

7.     Simon Citrat (Levine Koser).

Medium citrat sama dengan agar miring, warnanya hijau karena dibubuhi dengan indikator bromthymolblue.

Prinsip : Untuk mengetahui apakah bakteri-bakteri yang ditanam pada citrat, sanggup memecahkan Natrium-citrat, yang terdapat dalam medium menjadi NaOH dan asam citrat. Jika dapat dipecahkan maka suasana medium menjadi alkalis (basa) yang menyebabkan medium menjadi biru karena adanya indikator bromthymolblue. Jika tidak dipecahkan maka citrat tidak menjadi alkalis dan warnanya tetap hijau.

IMVIC test.

            Indol test, Methyl-red, Voges Proskauer dan Simon citrat, lazim dinamakan “IMVIC test”. Imvic test ini untuk membedakan (differensiasi) gol.coli. Ketiga jenis bakteri dari gol.coli pada Imvic test adalah sebagai berikut :

No	Jenis Bakteri	I	M	V	C
1	Escherisia coli	+	+	-	-
2	Esch. intermediet	-	+	-	+
3	Aerobacter aerogenes	-	-	+	+

(IO = uitilation citrate)

8.     Urea-agar.

 Perbenihan ini gunanya untuk mengetahui apakah bakteri dapat memecahkan urea atau mempunyai enzym urease.

Prinsip :

            Bila urea dipecah oleh enzym urease akan terbentuk : 2 NH₃ + CO₂. NH₃ ini menyebabkan suasana alkalis sedikit dan dengan indikator phenol-merah pada medium menyebabkan warna merah jambu. Perbenihan warna merah jambu, Urea test positif.

9.     T.S.A. (T.S.I. = Triple Sugar Iron Agar)

T.S.A. berisi 3 macam gula, yaitu : glukosa, laktosa, saccharosa. Yang sama fungsinya dengan T.S.A. adalah K.I.A. (Kligler Iron Agar), di dalamnya hanya terdapat 2 macam gula : laktosa dan glukosa. Indikator dipakai phenol-red, sehingga T.S.I. (KIA) ini warnanya merah.

Prinsip :

            Bila bakteri dapat memecahkan ferroammoniumsulfat dan protein yang mengandung S menjadi H₂S. Asam sulfida yang terbentuk ini dengan Fe⁺⁺ menjadi FeS yang berwarna hitam. Warna hitam ini nampak pada garis tusukan media.

~         Terbentuk H₂S atau warna hitam    : T.S.A. positif.

~         Tidak terbentuk H₂S                      : T.S.A. negatif.

Medium ini terutama digunakan untuk membedakan dan sebagai biakan muka (biakan awal) dalam pemeriksaan golongan Salmonella, Shigella, Vibrio dan golongan Coli.

10.  Perbenihan Endo-agar.

Medium Endo-agar untuk mengisolasi bakteri-bakteri usus Gram negatif staf, dalam mana dapat dibedakan (differensiasi) koloni-koloni dari coli-aerogenes dengan bakteri-bakteri usus pathogen (Salmonella, Shigella dan Vibrio). Bakteri-bakteri Gram negatif staf apathogen (coli aerogenes) membentuk koloni-koloni yang merah dengan/tanpa merah kilat logam. Sedangkan bakteri-bakteri pathogen yang tidak meragikan laktosa, membentuk koloni ynag tidak berwarna seperti titik air (Salmonella, Shigella dan Vibrio).

Prinsip Endo.

            Perbenihan Endo-agar mengandung bermacam-macam bahan, antara lain : laktosa, fuchsin-basis dan Na-sulfit.

a.     Fuchsin dengan Na-sulfit membentuk senyawa yang tidak berwarna ”leucofuchsinsulfit”, yang sifatnya labil dan mudah direduksi.

b.    Misalnya kita tanam E.coli pada Endo, maka coli ini memecahkan laktosa menjadi aldehyde, seterusnya menjadi asam gula. Aldehyde mempunyai sifat yang mereduksi.

c.     Oleh aldehyde leucofuchsinsulfit direduksi menjadi fuchsin dan sulfit kembali, sehingga pada tempat (koloni) E.coli tumbuh terjadi penguraian. E.coli mempunyai ciri koloni : merah kilat logam. Sedangkan koloni-koloni E.intermedium dan Aerobacter aerogenes mempunyai koloni-koloni yang merah jambu tanpa merah kilat logam.

Bakteri yang tidak memecahkan laktosa seperti : Salmonella, Shigella, Vibrio tidak berwarna.

11.  Perbenihan Wilson-Blair (Bismuth Sulfite Agar).

Perbenihan W.B.agar khusus unuk mengisolasi bakteri typhus (Salmonella typhi). Bahan-bahan yang terdapat dalam medium ini, antara lain : Bismuth ammonium-citrat dan Na-sulfite.

Prinsip :

            Bakteri (S.typhi) yang dapat menguraikan Bismuth ammonium-citrat dan Na-sulfite, sehingga terbentuk Bismuth-Sulfite yang warnanya hitam. Koloni-koloni dari S.typhi pada W.B.agar berwarna hitam dan dikelilingi oleh suatu daerah yang menghitam. Jika dilihat dengan cahaya memantul, maka daerah ini menunjukkan kilat logam. Salmonella lain seperti : S.paratyphi A, S.typhimurium, S.cholera suis, membuat koloni-koloni yang berwarna hijau dan mendatar.

12.  Perbenihan Tarozzi bouillon.

Tarozzi bouillon untuk bakteri-bakteri yang anaerob. Di dalamnya terdapat potongan-potongan hati, kalsium karbonat dan paraffine.

a.     Bouillon untuk pertumbuhan bakteri (media).

b.    Potongan hati, gunanya untuk menetralkan hydrogen peroksida (H₂O₂) dari udara, karena hati itu mengandung enzym katalase.

c.     Kalsium-karbonat, gunanya untuk menetralkan asam yang mungkin terbentuk.

d.    Paraffin yang terdpat pada permukaan medium, untuk mencegah supaya udara jangan masuk ke dalam perbenihan Tarozzi bouillon.