Pewarnaan Gram

  

Pewarnaan Gram ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli histologik Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas 2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama “kristal violet”. Sedangkan Gram negatif berwarna merah jambu karena melepaskan zat warna utama dan menangkap zat warna penutup ”fuchsin”. Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :

1.    Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang warnanya violet).

2.   Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol (J-KJ).

3.    Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau alkohol-asam.

4.   Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll.

Pulasan menurut Gram mempunyai banyak modifikasi, sebaiknya pakailah salah satu cara saja diantara yang banyak. Kesalahan biasanya terdapat pada ”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama memberikan zat-zat warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Gram-positif dapat menjadi Gram negatif. Teknik mewarnai hendaknya dikontrol juga dengan melakukan pemulasan terhadap bakteri yang telah diketahui Gramnya. Larutan-larutan zat warna yang digunakan senantiasa diperiksa, apakah sudah terdapat kristal-kristal atau kotoran-kotoran lainnya. Gunakanlah selalu larutan-larutan zat warna yang disaring dengan kertas saring.

Perlu kita ketahui bahwa perbedaan sifat antara kedua golongan bakteri tadi, tidaklah absolut tegas dan spesifik, melainkan tergantung juga pada beberapa faktor, antara lain:

a)    Bakteri-bakteri Gram positif sering kali tidak dapat menyerap dan mengikat zat warna kristal violet, terutama apabila dibuat preparat dari bakteri-bakteri biakan murni yang telah tua (rough).

b)   Ada bakteri-bakteri tertentu yang sangat peka terhadap cara-cara yang mengalami sedikit perubahan.

c)    Selain daripada itu ada juga bakteri-bakteri yang bersifat ”gram variable”, dll.

Gentian violet dapat diganti dengan crystalviolet atau methylviolet, jika gentian violet tidak ada.

·        Larutan Standard Gentian Violet.

Bubuk (kristal) gentian violet        : 5 gram.

Alkohol 95-96%                         : 95 ml.

·        Larutan Pakai.

Larutan standard gentian violet     : 10 ml.

Karbol (phenol) 5%                     : 90 ml.

·        Larutan Standard Fuchsin.

Bubuk (kristal) fuchsin         : 5 gram.

Alkohol 95-96%                   : 95 ml.

·        Larutan Pakai.

Larutan standard fuchsin      : 10 ml.

Aquadest                            : 90 ml.

Bubuk digerus dalam mortir dengan alkohol sedikit demi sedikit, setelah larut masukkan ke dalam botol (untuk gentian violet harus botol yang cokelat atau sawo matang). Genapkan volume alkohol sampai volume yang diperlukan. Biarkan 24 jam baru dapat dipakai. Jika hendak dipakai larutan stam ini harus diencerkan dahulu 10x dan disaring. Filtrat ini dipakai untuk pewarnaan.

·        Larutan Lugol (J-KJ).

Jodium kristal                     : 1 gram

Kalium jodida (KJ)               : 2 gram

Aquadest                            : 300 ml.

Mula-mula Jodium + KJ dalam kira-kira 10 ml aquadest. Sesudah jodium larut, genapkan volumenya menjadi 300 ml. Larutan lugol ini disimpan dalam botol yang sawo matang. Dapat juga kita sediakan larutan lugol dalam 5x atau 10x kuat. Pada waktu pemakaian encerkan dengan aquadest. Bila perlu disaring. Larutan lugol yang dibuat seperti di atas, langsung dipakai tanpa ditipiskan lagi.

A.    Cara pewarnaan Gram :

1. Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi) 3x di atas api Bunsen.
2. Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin), biarkan selama 5 menit.
3. Zat warna dibuang dan bubuhi dengan larutan mordant (lugol), diamkan selama kira-kira 1-3 menit.
4. Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur lagi).
5. Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan cat-penutup (counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2 menit.
6. Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak. Gram positif  = ungu. Gram negatif = merah.

B.    VARIASI PEWARNAAN GRAM yang digunakan di Bagian Pathologi Klinik Fakultas Kedokteran dan Rumah Sakit Dr. Cipto Mangunkusumo di Jakarta.

Larutan-larutan zat warna :

1.  Carbol Gentian Violet.

Gentian violet 1 gram; Phenol kristal 2 gram; Alkohol 95 % 10 ml dan aquadest ad. 100 ml. Gentian violet digerus dengan alkohol dalam mortir tambahkan phenol dan campur. Kemudian tambah air sedikit demi sedikit dengan mengaduk terus, biarkan 24 jam kemudian disaring.

2.  Larutan Lugol (J-KJ)

Jodium 1 gram, KJ 2 gram dan aquadest 300 ml. Geruslah Jodium bersama KJ hingga homogen, tambah air sedikit demi sedikit, biarkan 24 jam. Saring dan disimpan dalam botol yang cokelat. Larutan ini gunanya sebagai mordant.

3.  Larutan safranin (counter stain).

Safranin 1 gram, alkohol 95% sebanyak 4 ml dan aquadest 360 ml. Geruslah safranin dengan alkohol, tuangkan ke dalam botol, mortir berkali-kali dicuci dengan air, biarkan 24 jam. Saring dan siap untuk digunakan.

Cara pewarnaan :

~     Buat sediaan pada objek gelas, rekatkan di atas api Bunsen 3x, tunggu sampai dingin.

~     Pulas dengan karbol gentian violet selama 60 detik.

~     Cuci dengan aquadest, bubuhi lugol selama 30 detik.

~   Cuci dengan aquadest, buang zat warna dengan alkohol (decolorisasi) sampai tidak ada lagi warna yang dilepaskan dari sediaan. Boleh juga dicuci lagi dengan aquadest.

~     Pulas dengan larutan safranin (counter stain) kira-kira 30 detik.

~      Cuci dengan aquadest, biarkan kering dalam temperatur kamar dan periksa dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak.

Hasil pewarnaan Gram :

Bakteri Gram positif   : Biru-ungu (ungu kebiru-biruan).

Bakteri Gram negatif   : Merah kekuning-kuningan.

C.    Pewarnaan Gram modifikasi BURKE.

(Burke’s modifikation : J. Bact. 7: 159, 1922).

1.    Sediaan sesudah difiksasi 3x di atas api, dituangi dengan larutan 1% gentian violet (crystal violet) dalam alkohol, kemudian segera ditambah dengan larutan Natrium-Bikarbonat 5%, biarkan selama kira-kira 1 menit.

2.   Cuci degan air, bubuhi dengan larutan mordant yaitu larutan lugol ( 1 gram J + 2 gram KJ + 200 ml aquadest), biarkan selama 1 menit.

3.   Segera dicuci dengan air. Bubuhi larutan decolorisasi tetes demi tetes (bahan peluntur) yang terdiri dari : 1 bagian ether + 3 bagian aceton, sampai zat warna utama terlepas atau bahan peluntur tidak berwarna lagi.

4.   Bersihkan dengan air, kemudian bubuhi dengan larutan counter stain (cat penutup) safranin 0,5 % beberapa detik lamanya.

5.   Bersihkan dengan air, keringkan pada temperatur kamar, lihat dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak.

Gram positif : biru-ungu.

Gram negatif : merah kekuning-kuningan.

Catatan :

Sebagai counter-stain dapat juga digunakan karbol fuchsin encer, yaitu Karbol Fuchsin Z. Neelsen 1 ml + 9 ml aquadest (pengenceran 10x). Jika karbol fuchsin ini dipakai waktunya dipersingkat, paling lama 1 menit. Karbol fuchsin encer ini sering digunakan untuk memulas vibrio, waktunya kira-kira 5-10 detik. Vibrio berwarna merah jambu dan bentuk koma. Susunan pulasan karbol fuchsin lihat pada pewarnaan tahan asam.